如何設(shè)置小泰勒蟲(chóng)qPCR的陰性對(duì)照
qPCR污染防控、結(jié)果判讀等相關(guān)背景知識(shí)，小泰勒蟲(chóng)qPCR的陰性對(duì)照設(shè)置需嚴(yán)格遵循熒光定量PCR通用規(guī)范，同時(shí)適配小泰勒蟲(chóng)檢測(cè)的特異性需求，具體設(shè)置方法如下：
一、核心陰性對(duì)照類(lèi)型及設(shè)置要求
?無(wú)模板對(duì)照（NTC）?
?設(shè)置方式?：反應(yīng)體系中省略小泰勒蟲(chóng)DNA模板，其余組分（引物、探針、酶、緩沖液、無(wú)酶水）與樣本體系一致。
?作用?：監(jiān)測(cè)試劑、耗材、環(huán)境中的外源核酸污染，是所有qPCR實(shí)驗(yàn)的必設(shè)對(duì)照。
?判定標(biāo)準(zhǔn)?：正常情況下無(wú)擴(kuò)增曲線，若出現(xiàn)Ct值<35的陽(yáng)性信號(hào)，直接判定體系存在污染。
?無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照（-RT對(duì)照）?
?設(shè)置方式?：僅在RT-qPCR檢測(cè)小泰勒蟲(chóng)RNA樣本時(shí)設(shè)置，逆轉(zhuǎn)錄步驟中不加入逆轉(zhuǎn)錄酶，其余后續(xù)qPCR體系與樣本一致。
?作用?：排除RNA提取過(guò)程中殘留的基因組DNA污染，避免假陽(yáng)性結(jié)果。
?近緣物種特異性陰性對(duì)照?
?設(shè)置方式?：使用與小泰勒蟲(chóng)同源性較高的牛巴貝斯蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)等近緣物種的核酸作為模板，其余體系一致。
?作用?：驗(yàn)證探針引物的特異性，避免交叉擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性，適配小泰勒蟲(chóng)的物種檢測(cè)需求。
二、設(shè)置操作規(guī)范
所有陰性對(duì)照必須與待檢樣本在同一批次、同一反應(yīng)板上同步操作，不能單獨(dú)運(yùn)行。
陰性對(duì)照的加樣順序需優(yōu)先于待檢樣本，避免樣本核酸交叉污染陰性對(duì)照體系。
每96孔反應(yīng)板至少設(shè)置3個(gè)NTC對(duì)照，分布在反應(yīng)板的不同區(qū)域，全面監(jiān)測(cè)板內(nèi)污染情況。
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